在植物可溶性蛋白檢測中，“雜質"通常指兩類物質：
干擾測定的化學物質： 如色素（葉綠素、花青素）、多酚類物質、單寧、還原糖、有機酸等。
物理雜質： 如細胞壁碎片、未破碎的組織、沉淀物等。
如果不去除這些雜質，會導致吸光度異常（偏高或偏低）、反應液渾濁、或者蛋白被降解。以下是針對不同雜質的處理策略：
一、 針對色素和光合色素（葉綠素）的處理
植物葉片（尤其是綠色葉片）中富含葉綠素，它不僅本身有顏色，還會與考馬斯亮藍染料競爭結合或產生沉淀。
處理方法：
使用 PVP 或 PVPP（最chang用）：
原理： 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是多酚和色素的特異性吸附劑。
操作： 在提取緩沖液中加入 1% - 2% (w/v) 的PVP（不溶性PVP即PVPP效果更好，離心時容易沉降）。研磨前加入，它能通過氫鍵吸附多酚和色素，離心后隨沉淀去除。
丙酮/乙醇洗滌（針對高含量葉綠素）：
如果樣品葉綠素含量極gao（如幼嫩葉片），PVP難以wan全去除。
操作： 在離心前，向上清液中加入少量預冷的80%丙酮或乙醇（不要太多，否則會變性蛋白），混勻后離心。葉綠素會溶于上層有機相，蛋白沉淀在水相或界面（需注意此操作可能導致部分疏水性蛋白丟失，一般僅用于ji端情況）。
替代方案： 使用高濃度的提取液稀釋樣品，使色素的吸光度在595nm處的影響可以忽略不計。
脫色柱（層析法）：
對于非常復雜的樣品，可以通過Sephadex G-25凝膠柱進行脫鹽和去除小分子色素。
二、 針對多酚、單寧和醌類的處理
這些物質極易氧化（變褐），并與蛋白發生共價交聯（醌-蛋白反應），導致蛋白沉淀或測定值偏低。
處理方法：
抗氧化劑：
在提取液中加入 β-巰基乙醇 (0.1%-0.5%) 或 二硫蘇糖醇 (DTT) (1-5 mM)。它們能防止多酚氧化，保護蛋白巰基不被破壞。
注意： 過量的還原劑可能干擾Lowry法或BCA法，但在Bradford法中通常影響較小，若濃度過高需做對照。
螯合劑：
加入 EDTA (1-5 mM)，螯合金屬離子，阻斷多酚氧化酶（PPO）的活性，防止褐變。
防止酸性環境：
多酚氧化酶在酸性條件下活性較強，提取液通常調節至 pH 7.0-8.0。
三、 針對物理雜質和細胞碎片的處理
這是最基本的凈化步驟。
處理方法：
多層紗布/尼龍網過濾：
研磨后的勻漿液，先用 4-8層紗布 或 100-200目尼龍網 過濾，去除未磨碎的組織、大的纖維和砂粒。這一步能防止離心管沉淀過硬或損傷移液槍頭。
高速冷凍離心：
溫度： 必須是 4℃。低溫既能沉淀雜質，又能防止蛋白降解。
轉速和時間： 通常為 10,000 - 15,000 rpm (或10,000g - 20,000g)，離心 15-20 分鐘。
關鍵點： 取上清液時，務必小心不要吸起底部的沉淀層。如果上清液渾濁，說明離心不夠，需要重新高速離心。
四、 針對還原糖、脂質和次生代謝產物的處理
處理方法：
TCA/丙酮沉淀法（“臟"樣本的終ji凈化）：
如果樣品非常復雜（如果實、種子、富含樹脂的植物），簡單的緩沖液提取無法去除雜質。
操作：
將樣品磨碎后，加入 10% 三氯yi酸 (TCA) 的預冷丙酮溶液（含0.07% β-巰基乙醇）。
振蕩，-20℃沉淀過夜。
離心，棄去上清（此時糖、脂質、色素都溶解在丙酮中）。
用冷丙酮洗滌沉淀2-3次，直至沉淀變白。
揮發干丙酮后，用裂解液（如含SDS或NaOH的溶液）重新溶解蛋白沉淀。
優點： 極其純凈，去除了絕大多數小分子雜質。
缺點： 步驟繁瑣，部分蛋白可能在沉淀過程中丟失。
稀釋法（最jian單）：
如果雜質濃度不高，通過稀釋樣品來降低雜質濃度，使其干擾低于儀器的檢測誤差范圍。
核心口訣：
低溫加PVP  紗布去渣滓
離心取上清  抗氧化保真